Виявлення антигенів цвілевих грибів роду Aspergillus за допомогою амперометричних імуноферментних сенсорів

Цвілеві гриби роду Aspergillus нерідко виявляються при культуральних дослідженнях проб, відібраних із зовнішніх слухових проходів, носових пазух, а також при дослідженні мокротиння. При цьому Aspergillus fumigatus є основним збудником інвазивного аспергільозу, найбільш часто вражає бронхолегеневу систему, a Aspergillus niger здатний викликати різні захворювання ЛОР-органів, а також нерідко виділяється в асоціаціях з іншими збудниками мікозів. У той же час, довести етіологічну роль грибів у кожному конкретному випадку досить складно, оскільки цвілеві гриби нерідко розглядають як контамінацію, внаслідок поширеності їх спор в навколишньому середовищі.

Основу успішної терапії аспергільозу складають рання діагностика і своєчасне призначення ефективних антимікотиків. Однак діагностика цього захворювання утруднена внаслідок низької ефективності мікологічних і гістологічних досліджень, і як наслідок - необхідність проведення додаткових, дуже складних і дорогих досліджень (комп'ютерна томографія і рентгенографія легенів, бронхоскопія, біопсія вогнищ ураження). Підтвердженням інвазивного процесу є присутність в крові антигену відповідного гриба. Однак існуючі тести виявляють сукупність антигенів Aspergillus spp., і дозволяють достовірно визначати антиген лише у хворих з тяжкими формами аспергільозу.

У зв'язку з цим розробка чутливого і селективного способу визначення антигенів Aspergillus fumigatus і Aspergillus niger є досить актуальним завданням. Одним із способів вирішення цієї проблеми є використання імуноферментних сенсорів, що дозволяють проводити швидке, чутливе і селективне визначення біологічно активних речовин, у тому числі антигенів патогенних грибів.

Мета роботи: розробка амперометричних імуноферментних сенсорів (ІФП) для визначення антигену (Аг) цвілевих грибів Aspergillus niger і Aspergillus fumigatus. Розроблені ІФП складалися з биочувствительной частини, що включає спільно іммобілізовані антитіла (Ат) проти Aspergillus niger або Aspergillus fumigatus і ферментну мітку (холінестерази), і трансд'юсера (стаціонарного ртутно-плівкового електрода). В основі пропонованого варіанту імуноферментного аналізу лежить поєднання реакції утворення імунного комплексу Ат-Аг на поверхні биочувствительной частини сенсора з подальшою вольтамперометрической індикацією сигналу. Аналітичним сигналом служить висота катодного піка при потенціалі - 0,55, який відповідає електрохімічного процесу відновлення продукту реакції меркаптани (R2SH), що утворюється в результаті катализируемого холинэстеразой гідролізу специфічних сірковмісних субстратів, з матеріалом електрода ртуттю. Утворення імунного комплексу чинить активуючу дію на каталітичну активність іммобілізованої холінестерази, що проявляється у збільшенні аналітичного сигналу. Величина цього ефекту лінійно залежить від логарифма концентрації Аг в досліджуваному розчині. Діапазон визначуваних концентрацій складають 5х10-10-3х10 6 мг/мл для Аг Aspergillus niger і 1х108-1х10-4 мг/мл для Аг Aspergillus fumigatus.

Розроблені ІФП використовували для визначення антигенів Aspergillus fumigatus і Aspergillus niger в сироватках крові.
Дослідження сироватки крові пацієнта з підтвердженим незалежними методами (комп'ютерна томографія, культуральне дослідження індукованого мокротиння) діагнозом «аспергільоз легень» показало наявність Аг Aspergillus fumigatus в концентрації 0,018+0,002 мг/мл

Проведено визначення Аг Aspergillus niger в сироватці крові пацієнта з діагнозом «отомикоз» і «грибковий риносинусит», у якого, за даними культурального дослідження, виділено в значній кількості Aspergillus niger. Концентрація Аг склала (7,3±0,3)х10-6 мг/мл В той же час, при дослідженні сироваток крові пацієнтів з аналогічним діагнозом, у яких виявлялися інші види грибів (в т.ч. роду Candida, Penicillium), активуючого ефекту не спостерігалося, що вказує на досить високу селективність розробленого методу.
Таким чином, використання розроблених ІФП може бути доцільно при з'ясуванні етіологічної ролі цвілевого гриба Aspergillus niger, особливо при мікст-інфекціях, а також в якості додаткового інструменту комплексного лабораторного обстеження хворих при підозрах на інвазивний аспергільоз.

Загрузка...