Методи дослідження агрегації тромбоцитів

Агрегація тромбоцитів 
При активації тромбоцитів виникає однотипна реакція, що завершується активацією фосфоліпази. В результаті мембрана клітини стає податливою і може вступати в контакт з сусідніми клітинами. Внаслідок цього тромбоцити можуть агрегувати один з одним і утворювати тромбоцитарний тромб. Активація тромбоцитів - дуже важливий етап гемостатичного процесу, бо він лежить в основі як нормального гемостазу, так і патологічного утворення тромбів та дисемінованого внутрішньосудинного згортання. Постійне надмірна активація тромбоцитів - один з істотних етапів атерогенезу і судинних ураженні. Разом з тим із-за порушення активації тромбоцитів, уповільнення або припинення адгезії і агрегації, посилення дезагрегації виникають важкі геморагії. Активація тромбоцитів головним чином пов'язується з придбанням пластинками здатності до повноцінних адгезії та агрегації. Агрегація тромбоцитів може бути оборотною і безповоротною. Агрегація оборотна безпосередньо трансформується в агрегацію незворотну. Агрегація швидка необоротна, коли на тромбоцити діють тромбін, а також колаген-та АДФ у високих концентраціях. Останні теж збільшують виведення Са2+ в цитоплазму.
Найбільш поширені способи оцінки агрегації тромбоцитів полягають у дослідженні швидкості та ступеня зменшення оптичної щільності (збільшення світлопропускної здатності) тромбоцитарної плазми при перемішуванні з індукторами агрегації (при вивченні спонтанної агрегації вони не додаються). Освіта агрегатів тромбоцитів під дією стимуляторів може бути оцінений також візуально, або за допомогою мікроскопа.
Якісний макроскопічний метод
Принцип: Визначається візуально наявність або відсутність агрегатів тромбоцитів в пробірці, де досліджувана тромбоцитарна плазма перемішується зі стимулятором агрегації.
Реактиви: 1. 3,8 % розчин цитрату натрію. 2. Розчин АДФ в ізотонічному розчині натрію хлориду або буфері Міхаеліса рН 7,35 в концентрації 20 мкг/мл. 3. 0,85 % розчин хлориду натрію або буферу Міхаеліса, рН 7,35 (Веронал-ацетатний буфер Міхаеліса (пропис Оврена-Коллера): розчин А-диэтилбарбитуровокислый натрій - 7,35 м, ацетат натрію - 4,86 г, дистильована вода - 250 мл; буфер: розчин А - 250 мл, 4,25 % розчин натрію хлориду - 200 мл; 0,1 моль/л розчин НС1 - 217 мл, дистильована вода - 683 мл).
Обладнання: 1. Водяна баня на 37 °С. 2. Секундомір.
Матеріал для дослідження: Тромбоцитарна плазма, краще зі стандартним вмістом тромбоцитів (250000 в 1 мкл). За 7-10 днів до обстеження лікарські препарати відміняють, так як багато хто з них (дипіридамол і його похідні, ацетилсаліцилова кислота і її похідні, індометацин, гироксихлорохин, фенілбутазон, сульфин-пиразон, низькомолекулярні декстрани, трициклічні антидепресанти та ін) пригнічують агрегацію тромбоцитів.
Хід визначення: Набирають у пробірку 0,2 мл плазми і ставлять її у водяну баню при 37 °С. Через 1 хв додають 0,1 мл розчину АДФ і негайно включають секундомір. Похитуючи або струшуючи пробірку, зазначають час утворення в суміші великих агрегатів тромбоцитів.
Нормальні величини: 10-60 с.
Клінічне значення: При тромбастении Гланцмана агрегація тромбоцитів не настає.
Примітка: Дослідження агрегації тромбоцитів спільно з деякими іншими методами дозволяє виявити форми порушення функцій тромбоцитів.
Макроскопічним методом може бути досліджена також агрегація під дією колагену (в кінцевих концентраціях 20-50 мкг/мл), ристоцетина (ристомицина) і бичачого фібриногену (обидва в кінцевих концентраціях 1-1,5 мг/мл). У разі порушення реакції вивільнення тромбоцитів, агрегація не розвивається при перемішуванні з колагеном; для хвороби Віллебранда характерний дефект ристоміцин-агрегації; хвороба Бернара - Сульє розпізнається за відсутності одночасно ристоміцин - і фібриноген-агрегації.

Реактиви та обладнання: 1. розчини аггристина 12 і 15 мг/мл; 2. годинникове скло.
Матеріал для дослідження: багата тромбоцитами плазма цитратная
Хід визначення: До 0,45 мл багатої тромбоцитами плазми на годинному склі додають 0,05 мл розчину аггристина, і, постійно премешивая, починають відлік часу до появи видимих агрегатів ("симптом снігового вихору"). Для першого дослідження досить використовувати розчин аггристина концентрацією в 12 і 15 мг/мл В сумнівних випадках доцільно приготувати повний ряд розчинів. У всіх випадках тест слід починати з дослідження контрольної плазми, багатої тромбоцитами, яка змішана з розчином аггристина найбільшого розведення. Необхідно проводити два паралельні дослідження. Для реакції достатня кімнатна температура.
Оцінка результатів: У страждаючих хворобою Віллебранда агрегати не виникають або утворюються значно пізніше. Він менше, ніж агрегати контрольної плазми. При різниці у 10 сек результат дослідження свідчить про патологічні зміни, а при різниці в 5-10 із результат сумнівний. В останньому випадку дуже важливо провести дослідження повним поруч розбавлених розчинів.
Автоматизація досліджень агрегації тромбоцитів (із застосуванням агрегометра) 
(на прикладі двоканального лазерного аналізатора агрегації тромбоцитів/ лічильника 230LA: НВФ Біола, Росія, 121552, м.москва, вул. 3-я Черепковская, д.15А. Тел.: (495) 414-6748)
Методи і лежать в їх основі принципи: ТУРБІДИМЕТРИЧНИЙ МЕТОД Борна заснований на реєстрації змін світлопропускання збагаченої тромбоцитами плазми (ОТП), що дозволяє досліджувати не лише агрегацію тромбоцитів, але і зміна форми тромбоцитів. Однак зміна форми може маскувати початковий етап агрегації, а освіта малих агрегатів (50 - 100 тромбоцитів) може взагалі не позначатися на світлопропускании суспензії.
ФСП-МЕТОД дослідження агрегації тромбоцитів (Габбасов З.А. і співавт., 1989) заснований на аналізі флуктуацій світлопропускання, викликаних випадковим зміною числа частинок в оптичному каналі.

Загрузка...