Вибір сайтів рестриктазами

У 1975 році Томас і Девіс виявив, що EcoRI розщеплює ДНК фага в п'яти сайтах пізнавання з різним ступенем інтенсивності, яка може відрізнятися на порядок.  Подібні приклади були зареєстровані і для інших ферментів рестрикції.  Такі фактори, як фланкуючі послідовності, метилированная ДНК і число сайтів розщеплення, по всій видимості, впливають на ефективність розщеплення.  Розщеплення стійких сайтів може бути суттєво покращено за допомогою додавання добре расщепляемой ДНК і олигодезоксирибонуклеотидов, що містять сайт впізнавання, або спермидин. 

1) ферменти I-го типу розщеплюють ДНК на ділянках, віддалених від сайту впізнавання; вимагають як АТФ, так і S-аденозил-L-метіонін для функціонування; багатофункціональний білок, здатний як до рестрикції, так і до метилированию;

2) ферменти II типу розщеплюють ДНК у межах або на малих відстанях від конкретного сайту впізнавання, більшості необхідний магній; ферменти, що володіють однією функцією (рестрикційної), не здатні до метилированию;

3) ферменти III типу розщеплюють ДНК в місцях недалеко від сайту впізнавання; вимагають наявності АТФ (але не її гідроліз), S-аденозил-L-метіонін стимулює реакції, але не є обов'язковим; існує як частина комплексу, що включає метилазу;

4) ферменти IV типу розщеплюють метильованих ДНК. 

Рестриктази дізнаються певні нуклеотидні послідовності в молекулах ДНК.  Однак їх сайт-специфічне впізнавання може бути зменшено in vitro.  При певних умовах ферменти можуть розпізнавати і розщеплювати нуклеотидні послідовності, які відрізняються від канонічного сайту.  При низькій іонній силі, наприклад BamHI (з сайтом впізнавання GGATCC) здатна розщеплювати наступні послідовності: NGATCC, GPuATCC і GGNTCC.  Це явище називається «зірчастої активністю».  Для більшості випадків використання рестриктаз зірчаста активність не є бажаною. 

1) тривалої інкубації (сверхрозщеплення);

2) висока концентрація ферменту в реакційній суміші;

3) висока концентрація гліцерину в реакційній суміші;

4) наявність в реакційній суміші органічних розчинників, таких як етанол, диметилсульфоксид (ДМСО) або диметилформамід (ДМФА);

5) низька іонна сила реакції буфера;

6) субоптимальне значення рН реакційного буфера;

7) заміна Mg2+ іншими двухвалентными катіонами, такими, як Mn2+ або Co 2+. 

У деяких випадках, продукти ДНК, утворені в ході розщеплення рестриктазою канонічного сайту, стимулюють зірчасті активність ферменту. 

Недостатнє розщеплення ДНК і зірчаста активність призводять до атипових электрофореграммам, за яким при кропіткій вивченні ці два явища можна розрізнити.